GLP-1藥物以其出色的降糖、減重效果，登頂《科學》2023年度突破，被譽為人類對抗肥胖癥及其相關(guān)并發(fā)癥的長期斗爭中的重要里程碑。在看到司美格魯肽帶來的巨大收益以及市場預期，國內(nèi)預計已有上百家藥企入局GLP-1。在此背景下，工藝開發(fā)時間和生產(chǎn)成本效益成為該賽道取得成功的關(guān)鍵。賽分科技對該類藥物的生產(chǎn)工藝進行探索，開發(fā)出純化效率高、通用性強的GLP-1多肽藥物純化工藝。對于發(fā)酵類GLP-1多肽樣品僅使用兩款填料（Generik MC60-HIC Butyl+Bio-C8(2)）即可完成粗品到成品的純化。
GLP-1純化方案精華一覽
Generik MC60-HIC Butyl+Bio-C8(2)
a.高載量、高純度、高回收率
典型案例：
終產(chǎn)品純度達99.63%，已知單雜0.11%，未知單雜均小于0.1%
單步回收率90%左右，總收率約77.6%
反相純化載量15 mg/mL（2.5%）
b.物料成本低
Generik MC60-HIC Butyl純水洗脫，成分單一，洗脫體積小，適合放大
純水洗脫，節(jié)省酶切前和中純后兩次換鹽或稀釋步驟
填料壽命長，降低單次填料使用成本，降低質(zhì)量風險
c.時間成本低
工藝開發(fā)周期短，單針生產(chǎn)周期短
無需頻繁重裝柱子（無色素吸附等問題）
d.工藝穩(wěn)健，開發(fā)難度小
工藝開發(fā)簡單（0.5 M鹽上樣，純水洗脫）
工藝通用性強（目前已有10余個項目復制成功，成功率100%）
工藝穩(wěn)健性好，且容易放大
背景介紹
胰島血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）是由人胰高血糖素基因編碼，并由腸道L細胞分泌的一種肽類激素，屬于腸促胰島素家族，分泌受進食活動調(diào)節(jié)，具有血糖濃度依賴性降糖效應，是極有潛力的降糖藥物。為了優(yōu)化藥物作用效果，研究者采用改變氨基酸序列、嵌入非天然氨基酸、增加脂肪側(cè)鏈、偶聯(lián)蛋白或者PEG修飾，改變劑型等一系列措施，有效延長了GLP-1藥物的半衰期，提高患者使用便捷性，現(xiàn)已有多個GLP-1藥物在國內(nèi)上市（表1）。已上市藥物中長效的GLP-1藥物更受青睞，其中以司美格魯肽（索馬魯肽，Semaglutide）表現(xiàn)最為突出。與此同時，多靶點藥物逐漸成為未來研發(fā)趨勢，禮來雙靶點GLP-1藥物替爾泊肽（Tirzepatide，商品名為Zepbound）國外上市后取得亮眼的成績。
表1. 國內(nèi)上市GLP-1藥物
*此外已上市GLP-1多肽類藥物還有：阿必魯肽（GSK），替爾泊肽（Lily），未在國內(nèi)上市
GLP-1藥物蓬勃發(fā)展，國內(nèi)、外掀起多肽藥物開發(fā)熱潮，無論是原料供應商還是醫(yī)藥公司都紛紛布局，也加大了多肽藥物的競爭。在此環(huán)境下，高效穩(wěn)定的藥物生產(chǎn)方案可以縮短開發(fā)時長、實現(xiàn)降本增效，有利于提高藥物競爭優(yōu)勢。賽分科技推出從捕獲-中純-精制完整解決方案，已應用于多個項目，助力生物醫(yī)藥公司GLP-1項目從臨床到商品化進程。
GLP-1高效純化方案介紹
GLP-1藥物主要分為兩種生產(chǎn)方式，分別為生物發(fā)酵（代表藥物司美格魯肽、利拉魯肽）以及化學合成（代表藥物替爾泊肽、艾本那肽），一般而言發(fā)酵生產(chǎn)成本相對較低，發(fā)酵GLP-1多肽應用更廣。賽分科技基于GLP-1多肽藥物生產(chǎn)特點，開發(fā)一套適用于GLP-1藥物純化工藝，見圖1。對于發(fā)酵生產(chǎn)GLP-1藥物整體純化推薦兩款填料，分別為Generik MC-HIC Butyl加Bio-C8(2)。化學合成多肽則直接采用高效反相純化方案，滿足高載量、高純度以及高回收率的需求。
圖1. 脂肪鏈修飾GLP-1藥物純化工藝示意圖
下文以發(fā)酵生產(chǎn)司美格魯肽樣品為例，介紹賽分科技推薦GLP-1高效、經(jīng)濟、高純度的純化工藝。GLP-1捕獲及酶切步驟推薦使用Generik MC-HIC Butyl疏水層析填料。該填料具有較強的疏水性能，適用于樣品捕獲及酶切后純化，表2為該填料技術(shù)參數(shù)信息。
表2. Generik MC-HIC Butyl技術(shù)參數(shù)
大腸桿菌破菌上清液捕獲
采用Generik MC60-HIC Butyl疏水層析捕獲大腸桿菌破菌上清液，純化圖譜見圖2，采用Tris體系0.5 M NaCl作上樣緩沖液，無洗雜步驟，直接采用純水洗脫，減少試劑使用，雜質(zhì)直接在CIP后續(xù)步驟去除，工藝簡單可重現(xiàn)。
圖2. GLP-1大腸桿菌上清液捕獲及電泳檢測圖譜
采用Generik MC60-HIC Butyl捕獲破菌上清液，洗脫體積僅有1.8CV，樣品洗脫集中。上樣載量35 mg/mL。純化后凝膠圖譜顯示樣品純度顯著提升，收率>90%。
酶切后樣品純化
酶切后樣品采用與捕獲同一款填料Generik MC60-HIC Butyl，純化圖譜如圖3。純化步驟僅增加低鹽洗雜操作，同時載量保持在20 mg/mL，優(yōu)于一般反相填料載量。
圖3. 酶切后多肽樣品純化及HPLC分析圖譜
酶切后采用與捕獲同一款填料Generik MC60-HIC Butyl進行純化，載量為20 mg/mL。原樣及純化后樣品采用HPLC分析，樣品純度由52.14%提升至94.33%，收率>98%。純化工藝相對簡單，對比捕獲步驟僅增加洗雜工藝，且該純化方案穩(wěn)定，用于多個樣品純化，成功復刻。
修飾后純化
司美格魯肽采用脂肪酸側(cè)鏈修飾以延長藥物半衰期。經(jīng)過脂肪酸側(cè)鏈修飾后樣品疏水性顯著提高，且為保證藥物純度要求，脂肪酸修飾后GLP-1藥物多采用反相色譜純化，一般采用C8或者C18填料。文中實驗采用Bio-C8(2)純化司美格魯肽（純化及數(shù)據(jù)分析見圖4），流動相經(jīng)多次驗證以醋酸+乙腈體系純化效果良好，且成功應用于多個項目。反相純化載量可達15 mg/mL（2.5%），滿足高效純化需求。
圖4. 司美格魯肽樣品反相純化圖譜及純化效果分析
純化后根據(jù)不同質(zhì)量要求分別收集不同時間段樣品（合樣1與合樣2）進行分析檢測，具體樣品純化前后檢測結(jié)果見圖4。檢測方法采用HPLC結(jié)合高分辨反相色譜柱對純化前、后樣品進行分析，樣品純度從82.46%提升至99.63%，已知單雜0.11%，未知單雜均小于0.1%，同時回收率在88%以上。對于口服制劑質(zhì)量相對放寬，可增加收樣范圍，純度可達98.47%，回收率顯著提高至99.4%。
結(jié)語
賽分科技推薦發(fā)酵生產(chǎn)GLP-1藥物采用純化方案為Generik MC60-HIC Butyl加Bio-C8(2)，合成多肽藥物直接采用反相純化。兩款填料解決整體純化工藝，保證樣品高載量、高回收率、高純度，且工藝穩(wěn)健性好，適宜放大生產(chǎn)，同時降低整體純化流程的物料成本及時間成本，提高GLP-1藥物開發(fā)競爭優(yōu)勢。
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